Su Numunelerinde Yapılan Mikrobiyolojik Analizler

su-numunelerinde-mikrobiyolojik-analiz

Su analizlerinde mikrobiyolojik yaklaşım ve yasal bir yükümlülük olarak membran filtrasyon sistemi kullanılmaktadır. Membran filtrasyon uygulmasında iki farklı tip besiyeri kullanılabilir.
• Kullanıma hazır besiyeri
• Kullanıma hazır, özel bir yöntemle pedlere emdirilerek dehidre edilmiş besiyeri. Tespit edilecek mikroorganizmaya göre farklı türleri vardır.
Enfeksiyonların bulaşmasında birçok etken rol oynamasına rağmen, büyük salgınların çıkmasında ve yayılmasında doğal çevre ve özellikle su büyük önem taşır. Alt yapı yokluğu veya yetersizliği sonucu patojen mikroorganizmaların sulara karışması ve bu suların içme suyu olarak kullanılması sonucunda enfeksiyonlar ortaya çıkmaktadır. Su ile yayılan salgınlara su epidemileri denir, tehlikeli su epidemilerine sebep olabilen Salmonella, Vibrio ,Shigella, Brucella ve diğer birçok patojen bakteriler ve virüsler portörlerin dışkıları ile sulara karışabilir.

Bu arada temel amaç; sularda hastalık yapan mikroorganizmaların varlığının belirlenmesi ve suyun insan tüketimi için mikrobiyolojik kalitesinin belirlenmesidir. Hastalık yapan mikroorganizma kontrolü, halk sağlığı açısından önemlidir ve burada özellikle halk sağlığı yaklaşımının önemi açıkça ortaya çıkar.

Su yolu ile bulaşan bazı patojenler ve oluşturduğu hastalıklara kısaca örnek verirsek;

Enfektif, hepatitis; Sarılık olarak bilinen bu hastalık genellikle su ile yayılmaktadır.
Polimyelitis; Çocuk felcinin kirli sularla da yayıldığı bilinmektedir.
Taenia saginatta; insanlar bu parazitin yumurtasını taşıyan suları ağız yoluyla almak suretiyle hastalanırlar.
Ascaris lumbricoides; Ascariasis denilen hastalığa neden olan bu parazit daha çok çocuklarda görülür. Atık su tasfiye tesislerinde çalışanların %2 sinde, atık su ile sulama yapan çiftçilerin % 16’sında bu hastalık görülmektedir.

Sularda mikrobiyolojik analizler temel olarak aşağıdaki gibi gruplandırılabilir.
Var/Yok testleri: Mikroorganizmanın sayısı önemli değildir. Belirli bir hacim içinde belirli bir mikroorganizmanın olup olmadığı araştırılır.
Sayım: Varlığına genellikle belirli sınırlar içinde izin verilen mikroorganizmalar için yapılır.
Mikroorganizma tanımlama: Koloni sayımı, dökme ya da kültürel yayım şeklinde yapılabileceği gibi membran filtrasyon sisteminde de koloni sayımı gerçekleştirilebilir.

T.C. Sağlık Bakanlığı tarafından 17 Şubat 2005 tarih ve 25730 sayılı resmi gazetede yayınlanarak yürürlüğe giren ‘’İnsani Tüketim Amaçlı Sular Hakkında Yönetmelik’’, Coliform grup ve Escherichia coli’nin membran filtrasyon tekniği ile analizini hükme bağlamıştır. Bu yönetmelik coliform grup bakteriler ve Escherichia coli’nin Tergitol TTC laktozlu agar (GBL-0240) analizini göstermektedir.

Coliform grup bakteriler, Escherichia coli ve Pseudomonas aeruginosa için kullanıma hazır ürünlerimiz;
Endo Agar; LES (GBL- 0040): Ham maddeler, su, doğal kaynak suları, atık su, alkolsüz içecekler, meyve suları, şeker, şekerli ürünler ve diğer ürünlerdeki Escherichia coli ve Colifrom grup bakterilerin belirlenmesi için kullanılan besiyeridir.
MacConkey Agar (GBL-0315): İlaç, kozmetik, ham madde, su, doğal kaynak suları, atık su, meşrubatlar, alkolsüz içecekler, gıdalar ve diğer ürünlerde Coliform bakterilerin ve diğer Enterobacter türlerinin belirlenmesi için kullanılan besiyeridir. 0,45 μm; beyaz zemin üzerine yeşil çizgililer ile karelendirilmiş membran filtre ile kullanılır.
Setrimid Agar (GBL-0679) (Seçici kültür ortamı): İlaç, kozmetik, ham maddeler, su, atık su, gıdalar ve diğer ürünlerdeki Pseudomonas aeruginosa’nın tanımı ve sayımında kullanılır. Standart membran filtrasyon tekniği kullanılır.
King’s B Besiyeri (GBL-0645) (Doğrulayıcı kültür ortamı): Pseudomonas aeruginosa analizinde doğrulama için kullanılmaya uygundur.
Nutrient Agar (GBL-0218) (Doğrulayıcı kültür ortamı): Pseudomonas aeruginosa insan için fırsatçı patojen bir organizmadır. Suda, nemli topraklarda veya bitkilerin yüzeyinde saprofit konumunda yaşamaktadır. Besin maddelerinin çok düşük düzeyde bulunduğu sular içerisinde bile üreyebilmektedir.

Escherichia coli ve Coliform Bakterilerin Araştırılması ve Sayımı ve
Membran Filtreleme Yöntemi (TS ENISO9308‐1): 

Su numunesinin belirli bir hacmi membran filtreden geçirilir; membran filtre bir seçici besiyerine konulur;
* 36°C ± 2°C ve 44°C ± 1°C sıcaklıkta 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saatinkübe edilir;
* Laktoz Pozitif olarak tanımlanmış olan tipik koloniler okunur ve sayılır;
* Koliform veya Escherichia coli olarak doğrulanmış tipik koloniler sayılır.

Coliform bakteriler: 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saat içerisinde 36°C ± 2°C sıcaklıkta seçici kültür ortamında laktozdan asit oluşturan,fakültatif anaerob ve oksidaz negatif bakterilerdir

Escherichia coli : 44°C ± 1°C sıcaklıkta 21saat ± 3saat ve 44saat ± 4saatiçerisinde triptofandan indol oluşturan koliform bakterilerdir.

Seyreltici
– Tuzlu peptonlu su: TPS
Seçici kültür ortamı
– Tergitol TTC laktozlu agar (GBL-0240)
Doğrulayıcı kültür ortamı ve reaktifler
– Seçici olmayan agar: (Triptofan Soy Agar (TSA) gibi) (GBL-0361)
– Triptofan buyyonu
– Oksidaz reaktifi (GBL-0534)
– Kovaks reaktifi (GBL-0525)

Filtreleme:
* İncelenecek numune çalkalanarak homojenleştirilir;
* Laboratuvar içerisinde hazırlanan talimat doğrultusunda numunenin cinsine göre 100 veya 250 mL membran filtreden geçirilir ve membran filtre TTC‐Tergitol laktozlu agar besiyeri (GBL-0098) üzerine yerleştirilir;
* İşlem, istenmeyen üremenin engellenmesi amacıyla 44ºC’de inkübe edilecek diğer petri için ikinci kere tekrarlanır.

İnkübasyon:
* Bu şekilde hazırlanmış petrilerden biri 21saat ± 3saat boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir. Deneyin hassasiyetini arttırmak için süre 44saat ± 4saate uzatılıp ikinci okuma işlemi gerçekleştirilir.
* Diğer petri 21saat ± 3saat boyunca 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir. Süre 44saat ± 4saate uzatılıp ikinci okuma işlemi gerçekleştirilir.

Okuma:
* Genellikle koliformlar, membranın altından görülebilen sarı bir hale içerisinde sarı veya turuncu renkte koloniler oluştururlar. Escherichia coli ve Enterobacter aerogenes kolonileri, en sarı renkteki kolonilerdir. Bazı koliform bakteriler yeşilimtrak veya pembe koloniler de oluşturabilmektedir.
* Az bile olsa, sarı bir halenin olması, doğrulaması yapılacak şüpheli kolonileri işaret etmektedir.
* Ancak, her ne kadar ikincil bir gösterge oluşturuyor olsa da, doğrulaması yapılacak kolonlerin rengi dikkate alınmalıdır. Böylece, sarı bir halenin olması halinde, doğrulanacak koloniler öncelikli olarak sarı (ortasında pas olan veya olmayan) ve kırmızı turuncu kolonilerdir; daha az temsil edilen yeşilimtrak veya pembe koloniler de doğrulanmalıdır.

Doğrulama ve sayım:
Aşağıdaki durumlar hariç, ileri ekimler öncelikli olarak 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petrilerden yapılmaktadır.

* Eğer 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petri üzerinde daha fazla sayıda tipik koloni var ise; bu durumda, 36°C ± 2°C ve 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petrilerin tipik kolonileri doğrulanır,
* Eğer 36°C sıcaklıkta inkübe edilmiş petri istenmeyen flora ile istila edilmiş ise (100-150’den fazla karakteristik olmayan koloni); bu durumda, sadece 44°C sıcaklıktaki petride bulunan koloniler doğrulanır.

Oksidaz:
* TSA (GBL-0361) üzerine ekim yapılır ve 21saat ± 2saat boyunca 36°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir;
* İki‐üç damla taze hazırlanmış oksidaz reaktifi (GBL-0534) bir süzgeç kağıdı üzerine damlatılır.
* Cam, tahta, plastik veya platin (nikel krom olmayan) öze ile TSA’da oluşan koloninin bir kısmı hazırlanan süzgeç kağıt üzerine sürülür. 30 sn içerisinde koyu mavi‐mor rengin oluşması pozitif reaksiyon olarak kabul edilir.

Coliform bakteriler oksidaz negatiftir: Kağıt üzerinde renklenme gerçekleşmez.

İndol üretimi:
* Triptofan buyyonu tüpüne ekim yapılır ve 21saat ± 3saat boyunca 44°C ± 1°C sıcaklıkta inkübe edilir;
* 0,2‐ 0,3 mL Kovaks reaktifi (GBL-0525) konarak indol üretimi kontrol edilir.
Buyyonun yüzeyinde kırmızı rengin oluşumu indol üretimini doğrular.

Membran Filtreleme Yöntemi İle Pseudomonas aeruginosa Tayini Ve Sayımı (TS EN 12780)

* Su numunesinin belirli bir hacmi membran filtreden geçirilir ve membran filtre seçici besiyerine konulur.
* 44saat ± 4saat boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir.
* Tanımlanan tipik koloniler okunur ve doğrulanır.
* Doğrulanan tipik koloniler sayılır.

Seyreltici
‐ Tuzlu peptonlu su: TPS (GBL-0646)

Seçici kültür ortamı
‐ CN Agar (Cetrimit Agar alternatif) (GBL-0679)

Doğrulayıcı kültür ortamları
‐ Nutrient Agar (GBL-0218)
‐ King B besiyeri (GBL- 0645)
‐ Asetamit Buyyon (GBL-0311)
‐ Oksidaz Reaktifi (GBL-0534)
– Nessler Reaktifi (GBL- 3224)

Filtreleme:
*Analiz edilecek numune çalkalanarak homojenleştirilir;
*Laboratuvarda Kullanım Talimat doğrultusunda numunenin 250 mL’si 0,45μm por çaplı steril selüloz ester membran filtreden geçirilir ve membran filtre bir CN Agar (GBL-0679) petrisi üzerine konulur.

İnkübasyon:
‐ Bu şekilde hazırlanmış petriler 44saat ± 4saat boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir.

Okuma:
* Membranlar 22saat ± 2saat sonra koloni gelişimi açısından incelenir;
* Mavi‐yeşil pigmentasyona (piyosiyanin) sahip bütün koloniler doğrulanmış Pseudomonas aeruginosa olarak kabul edilir;
* UV ışın altında membranlar incelenir (uzun süre maruz bırakmadan): Piyosiyanin üretmeyen ve floresan oluşturan koloniler olası Pseudomonas aeruginosa olarak kabul edilir ve asetamit buyyon kullanılarak doğrulama yapılır; Kahverengi‐kırmızı pigmentasyona sahip ve floresan oluşturmayan diğer bütün koloniler olası Pseudomonas aeruginosa olarak kabul edilir ve Oksidaz deneyi, asetamit buyyon ve King B besiyeri kullanılarak doğrulama yapılır.

Oksidaz:
Bütün seçilen kolonilerin Nutrient agar (GBL-0218) üzerine ekimi yapılır ve 36°C ± 2°C sıcaklıkta 22saat ± 2saat boyunca inkübe edilir.

Oksidaz Reaktifi (GBL-0534) kullanılarak oksidazın araştırılması:
* 2‐3 damla taze hazırlanmış Oksidaz reaktifi bir süzgeç kağıdı üzerine damlatılır
* Nutrient agarda (GBL-0218) oluşan kolonilerin bir kısmı platin, plastik veya cam öze ile kâğıt üzerine yayılır; 10 sn içerisinde koyu mavi‐mor rengin oluşması pozitif reaksiyon olduğunu göstermektedir.

Amonyak üretimi:
Nutrient agarda (GBL-0218) izole edilen koloni Asetamit buyyon (GBL-0311) içeren bir tüpe ekilir ve 22saat ± 2saat boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir.

Amonyak üretiminin araştırılması:
* Asetamit buyyon (GBL-0311) tüpü üzerine 1‐2 damla Nessler reaktifi (GBL-3224) eklenir.
* Yoğunluğa göre, sarıdan tuğla kırmızısı rengine kadar değişen bir rengin meydana gelmesi amonyak üretimini gösterir (5 dakikayı aşan sarı renk oluşumu dikkate alınmamaktadır).

King B’de floresan oluşumu
Kahverengi‐kırmızı renkli ve oksidaz pozitif kültürler Nutrient agardan (GBL-218) King B besiyerine (GBL-0645) ekilir ve en fazla 5 gün boyunca 36°C ± 2°C sıcaklıkta inkübe edilir.

Floresan oluşumunun araştırılması:
* UV ışınlar altında gelişim günlük incelenir.
* 5 gün içerisinde ortaya çıkan bütün floresanlar pozitif olarak kaydedilir.

Yazar: Kutlay HELVA / Biyolog
GBL Doküman No: M_0001_04
Yayın Tarihi: 07.03.2013
Revizyon No: 01

Kaynaklar:
Prof. Dr. Kadir HALKMAN (Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü)
T.C Sağlık Bakanlığı İnsani Tüketim Amaçlı Sular Hakkında Yönetmelik ( 17 Şubat 2005/25730 )

 

10 Responses to “Su Numunelerinde Yapılan Mikrobiyolojik Analizler”

  1. hatice diyor ki:

    salmonella ISO da hangi yürürlükte çalışıyor içeriği ile birlikte gönderebilirmisiniz

  2. Kutlay Helva diyor ki:

    Salmonella için EN ISO 6579 adlı standartı uygulanmaktadır. Standart detayına sadece http://www.tse.org.tr adresinden ulaşabilirsiniz.
    Konuyla ilgili başka sorunuz olursa yorum yazarak bize iletebilirsiniz.
    Saygılarımla.

  3. vhpzln diyor ki:

    Arkadaslar asetamit buyyon hazir besiyeri varmidr? varsa bana marka ismlerini yazabilir misinz?

  4. Şener Bahadır diyor ki:

    Merhaba arkadaşlar

    Koyun kanlı agar su mikrobiyolojisinde ne amaçla kullanılabilir ve Slanzet bartley agar ile arasındaki fark nedir ?

    • Fatih diyor ki:

      Sayın Şener Bahadır,

      Sorunuzla ilgili en kısa sürede, ekibimiz tarafından bilgilendirileceksiniz.

      Saygılarımla.

  5. Kutlay Helva diyor ki:

    Merhaba;
    GBL_0262 Slanetz-Bartley Agar mikrobiyolojik analizlerde su ve diğer sıvı örneklerinden membran filtrasyon yöntemiyle enterokokların sayımı için kullanılan besiyeridir.
    GBL_0854 Koyun Kanlı Agar mikrobiyolojik analizlerde, başta zor gelişenler olmak üzere mikroorganizmaların geliştirilmesi ve hemoliz reaksiyonlarının belirlenmesi amacıyla kullanılan besiyeridir. Su numunelerinde kullanılması uygun değildir.
    Eğer su numunelerinde patojen Staphylococcus analizi yapmak istiyorsanız daha spesifik bir besiyeri olan GBL_0665 DNAse Agar, Metil Yeşilli öneririz.
    Saygılarımla.

  6. Şener Bahadır diyor ki:

    Teşekkür ederim yanlış araştırma sonucu yanlış besiyeri alımı yaptım …

  7. Şener Bahadır diyor ki:

    merhaba,

    Fakat :D burada eksik olan birşey var

    Fekal Streptecocci ve Fekal Koliform doğrulama analizi nasıl yapılır?

    • Kutlay Helva diyor ki:

      Fekal streptekoklar enterekok olarakda bilinen streptekoklardır. Su örneklerinin analizinde yüksek sayıda saptanan enterekoklar fekal kontaminasyon göstergesi olarak kabul edilirler. Sayım standart EMS yöntemi ile yapılabileceği gibi membran filtrasyon yöntemiylede yapılabilir. Membran filtrasyon yöntemi için GBL_0262 Slanetz-Bartley Agar veya GBL_0158 Enterokok Agar kullanabilirsiniz. Fekal koliformlar koliform grubunun bir alt grubudur ve dışkı kökenlidirler. Fekal koliform olarak tanımlanan bakteri öncelikle E.coli’dir. Blog yazımızda E.coli tanımlanması ile ilgili belirtmiş olduğumuz yöntemleri uygulayabilirsiniz.

Bir yorum yazın.